Técnicas de laboratorio para Bioquímica
El uso de técnicas para aislar, purificar, identificar y comprender las estructuras de los compuestos puede conducir a una comprensión química del fenómeno biológico que resulta de las interacciones químicas que forman la base de la bioquímica. Las técnicas más comunes son:
Cromatografia: es el término colectivo para un conjunto de técnicas de laboratorio para la separación de mezclas. La mezcla se disuelve en un fluido llamado fase móvil, que la transporta a través de una estructura que contiene otro material llamado fase estacionaria. Los diversos componentes de la mezcla viajan a diferentes velocidades, lo que hace que se separen. La separación se basa en la división diferencial entre las fases móvil y estacionaria. Las diferencias sutiles en el coeficiente de partición de un compuesto dan como resultado una retención diferencial (Rf) en la fase estacionaria y, por lo tanto, cambian la separación. Se llama cromatografía porque se utilizó para la separación de pigmentos vegetales por primera vez y resultó en la separación de colores. Existen distintos tipos de cromatografía:
- Cromatografia de columna
- Cromatografia de placa
- Cromatografia líquida
- Cromatografia de gases
Electroforesis:es un proceso de purificación de proteínas, en el que las proteínas se separan por sus puntos isoeléctricos. El punto isoeléctrico de una proteína (pI), es el pH característico en el que una proteína no tiene carga neta. La carga neta de una proteína está determinada por la acidez o basicidad de las cadenas laterales que componen la proteína. Si una proteína tiene más grupos ácidos que grupos básicos, entonces la proteína tendrá un pH muy bajo y se considerará ácida. Si la proteína tiene más grupos básicos en sus cadenas laterales que grupos ácidos, entonces la carga general de la proteína hará que su pH sea mucho más alto.
La técnica aprovecha estas propiedades con los siguientes pasos:
- Elaborar un gel que tenga un gradiente de pH lineal dentro de él.
- Insertar las muestras de proteína en el gel.
- Aplicar un campo eléctrico con un ánodo (+) en un extremo y un cátodo (-) en el otro.
- Dejar tiempo para que las proteínas migren hacia su pI neutral de acuerdo con su carga neta.
Esta técnica permite la purificación de proteínas basándose en una característica de proteína diferente, pI. Por lo tanto, las proteínas con características similares, como un peso molecular, pueden purificarse y separarse a través de sus distintos pI en períodos de tiempo bastante cortos.
Espectroscopia: es el estudio de la interacción entre la materia y la radiación electromagnética. Se usa como herramienta para determinar la presencia de una sustancia en particular en una muestra y, en muchos casos, para cuantificar la cantidad de sustancia presente.
- Espectofotómetro UV-visible: Esta técnica en su espectro de UV lejano (ultravioleta) puede revelar características importantes de la estructura secundaria de proteínas. Mientras en su espectro de UV cercano (> 250 nm) nos proporciona información sobre la estructura terciaria y finalmente en su espectro visible es una técnica muy poderosa para estudiar las interacciones metal-proteína.
- Espectroscopia IR: esta técnica es un método rápido y eficaz para identificar la presencia o ausencia de grupos funcionales simples dentro de un compuesto.
- RMN: Con esta técnica las señales de absorción de diferentes núcleos pueden verse perturbadas por núcleos adyacentes. Esta información se puede utilizar para determinar la distancia entre núcleos. Estas distancias, a su vez, pueden usarse para determinar la estructura general de una proteína.
Cristalografia de rayos X: es una herramienta que se utiliza para identificar la estructura atómica y molecular de un cristal, en la que los átomos cristalinos hacen que un haz de rayos X incidentes difracte en muchas direcciones específicas. Al medir los ángulos e intensidades de estos haces difractados, un cristalógrafo puede producir una imagen tridimensional.
También se pueden usar etiquetas (de fluorescencia) para dar una lectura visual de una proteína o usar bacteriófagos para estudiar ciertas interacciones.