SiRNA

Los siRNAs son moléculas de ARN doble hebra de 20-21 nucleótidos complementarias, estas se originan a partir de un ARN largo de doble hebra (double strand RNA o simplemente dsRNA). Método de actuación.

Los dsRNAs pueden ser de origen endógeno (por ejemplo los transcritos o generados a partir de secuencias de ADN repetidas en tándem), o de origen exógeno (como virus o transgenes). El enzima responsable del procesamiento del dsRNA en moléculas de siRNAs es el Dicer. El enzima Dicer corta el dsARN y genera siRNAs o miRNAs. Estos ARN pequeños se incorporan en el complejo RISC (RNA-induced silencing complex), dirigiéndolo contra el ARNm complementario, y bien lo corta (siRNAs), bien inhibe su traducción (miRNAs).

Los siRNAs suprimen la expresión de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero (ARNm) complementario en dos mitades, a través de la interacción de la hebra antisentido del siRNA con el complejo RISC (RNA-induced silencing complex). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que conlleva la supresión de la expresión del gen.

Por otro lado, los siRNAs promueven la modificación del ADN, facilitando el silenciamiento de la cromatina, ya que favorecen la expansión de los segmentos de heterocromatina, a través del complejo RITS (RNA-induced transcriptional silencing).

Tras numerosos estudios, se ha podido observar con más detalle el mecanismo de acción de RNAi. Cuando se introducen en un organismo (plantas o nemátodos), el ARN exógeno es reconocido por la célula y unido a la enzima Dicer, la cual corta el dsRNA en fragmentos de alrededor de 22 nucleótidos.

Estos dsRNAs (siRNAs) se incorporan en un complejo con múltiples componentes, denominado RISC (RNA-induced silencing complex). El complejo RISC tiene que ser activado (RISC*) a partir de una forma latente, mediante el desapareamiento de las dos hebras de los siRNAs.

RISC* utiliza la hebra antisense del siRNA como guía para seleccionar su substrato: el ARNm complementario de la hebra de siRNA presente en el complejo. A continuación, RISC* promueve el corte y posterior destrucción del ARNm diana, provocando la supresión de la expresión del gen.

En Drosophila y en mamíferos, la hebra antisense se incorpora directamente en el complejo RISC para identificar el mRNA complementario, que será destruido. En ausencia de siRNAs, el complejo RISC carece de especificidad para unirse a ninguna molécula de ARNm. Pero cuando se une a la hebra guía del siRNA, el complejo RISC (ahora activado) puede participar en repetidos ciclos de degradación específica del ARNm diana, produciendo el silenciamiento de la expresión del gen correspondiente. En la mayor parte de los casos, la supresión no es completa, por lo que produce una reducción de la expresión, denominada knock-down. En plantas y en gusanos, después de que Dicer haya procesado el dsRNA originario, la hebra antisense de los siRNAs (primarios) se utiliza en un proceso de amplificación. La hebra antisense, unida a una ARN polimerasa-dependiente de ARN (RdRP o RNA-dependent RNA polymerase), puede aparearse con un ARNm complementario, y actuar como punto de inicio para la síntesis de una nueva molécula larga de dsRNA. Dicer actúa entonces sobre éste dsRNA, fragmentándolo para generar nuevas moléculas de siRNA (secundarias), que son específicas para diferentes secuencias del mismo ARNm, generando un efecto de amplificación. También en este caso, el ARNm unido a siRNAs es destruido, produciendo el silenciamiento (knock-down) del gen correspondiente.

Esta amplificación en plantas y gusanos permite que el efecto de silenciamiento producido por RNAi se extienda a través de los tejidos somáticos, no reproductivos, por transferencia de dsRNAs directa de célula a célula, generando una amplia resistencia a las infecciones virales.

Conclusión

Por tanto, el mecanismo de RNAi mediado por siRNAs suprime la expresión génica a nivel post-trancripcional (ya que la molécula diana es el ARNm), de manera específica a la secuencia. Los resultados de este tipo de supresión son similares (a veces idénticos) a los fenotipos de los mutantes nulos: la supresión puede producir una reducción significativa (knock-down) o completa (knock-out) de los niveles de la proteína diana. La supresión génica (también llamada silenciamiento) realizada por los siRNAs es extremadamente específica, y sólo afecta al ARNm homólogo (aunque con siRNAs sintéticos pueden producise efectos inespecíficos, denominados efectos off-target; ver más adelante). En plantas, el RNAi se denomina "silenciamiento génico post-transcripcional" (PTGS, del inglés post-transcriptional gene silencing), mientras que en Neurospora (un hongo también utilizado como organismo modelo) se denomina quelling. Estos mecanismos permiten la defensa contra la invasión viríca o de elementos transponibles. Los efectos sistémicos probablemente se explican por el pequeño tamaño de los siRNAs, que pueden pasar de una célula a otra. La amplificación de la señal que se observa en ciertos organismos (plantas, C. elegans) resulta de un mecanismo por el cual los siRNAs antisense se aparean al ARNm homólogo y funcionan como cebador para la transcripción de un ARN antisense por una ARN-polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que se aparea con el ARNm homólogo y da lugar, tras la acción de Dicer, a la aparición de siRNAs secundarios.

Aplicaciones

La especificidad y la robustez del efecto de RNAi sobre la expresión génica hace de este mecanismo una valiosa herramienta en investigación, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos, ya que dsRNAs o siRNAs sintéticos o transgénicos pueden introducirse en las células para inducir el silenciamiento selectivo de genes específicos de interés. Esto ha permitido un avance espectacular en el desarrollo de la biología celular, ya que el RNAi es una herramienta simple y rápida para la comprensión de la función de los genes (a pesar de que en último término es conveniente desarrollar el organismo knockout para asegurar la consistencia de los resultados). La técnica de RNAi en el laboratorio también puede utilizarse para silenciar sistemáticamente cada uno de los genes de la célula (análisis genómico), lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular en particular, como la división celular o las vías de señalización. De hecho, en la actualidad existen colecciones a gran escala de RNAi de mamíferos disponibles públicamente, tanto en empresas comerciales (Dharmacon, Ambion, Qiagen o Sigma como en instituciones académicas. Por otro lado, la explotación de la vía de RNAi es también una herramienta prometedora en biotecnología y medicina. Como comparación en la generación de modelos animales para el estudio de enfermedades:

• la obtención de una línea de ratones knockout puede precisar años, aunque una vez obtenidos, se pueden mantener indefinidamente, mediante cruces

• la obtención de una línea de ratones transgénicos para RNAi (a los que se les ha introducido un vector que exprese una molécula de siRNA para silenciar un gen específico, de forma constitutiva o condicional), puede conseguirse en meses, y también pueden mantenerse indefinidamente, mediante cruces

• por otro lado, se pueden inyectar localmente moléculas de siRNA (por ejemplo en la retina), lo cual puede realizarse en un tiempo corto (semanas), y puede mantenerse durante meses o indefinidamente (si los siRNAs se introducen en forma de vectores virales) o bien durante algunas semanas (si se utilizan siRNAs sintéticos)

• finalmente, los siRNAs se pueden inyectar de forma sistémica (en el sistema circulatorio), y como en el caso anterior, pueden mantenerse durante semanas, meses o indefinidamente, según la forma en la que se introduzcan en el organismo.

Genómica funcional

La mayoría de las aplicaciones de RNAi en genómica funcional en animales han utilizado C. elegans y Drosophila, ya que éstos son los organismos modelo en los que el mecanismo de RNAi es más efectivo.

C. elegans es particularmente útil para la investigación con RNAi por dos razones:

• los efectos de silenciamiento de genes son normalmente heredables

• porque la administración de dsRNA es extremadamente simple.

Aunque la administración es más difícil en otros organismos, también se están haciendo esfuerzos para realizar estudios genómicos a gran escala en células de mamíferos. La genómica funcional utilizando RNAi es una técnica particularmente atractiva para el mapeo y anotación genómicos en plantas, porque muchas plantas son poliploides, lo que representa un reto significativo para métodos genéticos más tradicionales. Por ejemplo, el RNAi ha sido utilizado con éxito para estudios genómicos funcionales en el trigo del pan (que es hexaploide), así como en los sistemas modelos de plantas más comunes, como Arabidopsis y el maíz.

Medicina

En el caso que nos ocupa, puede darse la utilización del mecanismo de RNAi en terapia. Aunque es difícil introducir dsRNAs largos en células de mamíferos debido a que éstos desencadenan la respuesta de interferón, el uso de siRNAs (sintéticos o shRNAs) ha tenido más éxito. Entre las primeras aplicaciones en llegar a la fase de ensayos clínicos, se encuentra el tratamiento de la degeneración macular y el virus respiratorio sincitial. El RNAi también se ha mostrado efectivo en la reversión de fallo hepático inducido en modelos de ratón.

Otros usos clínicos propuestos se centran en terapias antivirales, incluyendo la inhibición de la expresión génica viral en células cancerosas, silenciamiento de los receptores y correceptores del HIV en el huésped, el silenciamiento del virus de la hepatitis A y de la hepatitis B, el silenciamiento de la expresión del virus de la gripe71 asi como la inhibición de la replicación del virus del sarampión, etc… También siguiendo otro horizonte en la terapia génica, se han propuesto tratamientos potenciales para enfermedades neurodegenerativas, prestando atención particular a las enfermedades de poliglutaminas tales como la enfermedad de Huntington. La interferencia de ARN también se considera una alternativa prometedora para tratar el cáncer, mediante el silenciamiento diferencial de genes sobreexpresados en células tumorales o genes involucrados en la división cellular (mitosis).

Un área clave de investigación en el uso de RNAi en aplicaciones clínicas es el desarrollo de un método de administración seguro, que hasta el momento implica sobre todo el uso de sistemas de vectores virales similares a los que se utilizan en terapia génica, aunque también se utilizan otros mecanismos como aerosoles, estos han demostrado no tener tanta eficacia.

A pesar de la proliferación de estudios en cultivos celulares para medicamentos basados en RNAi, existen algunas preocupaciones en relación a la seguridad del RNAi, especialmente debido a los posibles efectos off-target (Efectos inespecíficos), en los que un gen con una secuencia similar al gen diana es también silenciado.

Un estudio de genómica computacional ha estimado que la tasa de error debido a efectos off-target es aproximadamente del 10%.Un importante estudio de enfermedad hepática en ratón produjo una alta tasa de mortalidad en los ratones experimentales, debido según los investigadores a la sobresaturación de la vía del RNAi, a causa de la utilización de shRNAs que deben procesarse en el núcleo y exportarse al citoplasma por un mecanismo activo. Todas estas son consideraciones que están bajo intenso estudio en la actualidad, para reducir su impacto en la utilización terapéutica del RNAi.

Biotecnología

La interferencia de ARN se ha utilizado en aplicaciones de biotecnología, particularmente en el diseño de plantas alimenticias que producen niveles bajos de toxinas naturales de plantas. Esta técnica aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas. Por ejemplo, las semillas de algodón son ricas en proteínas nutritivas, pero contienen de forma natural un terpenoide tóxico, el gossypol, y por tanto lo convierte en no apto para el consumo humano. Se ha utilizado RNAi para producir cepas de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintetasa, una enzima clave en la producción de gossypol, sin afectar la producción de gossypol en otras partes de la planta, donde el gossypol es importante en la prevención del daño producido por los agentes infecciosos de la planta. Esfuerzos similares se han dirigido hacia la reducción del producto natural cianogénico linamarino en plantas de yuca.

Aunque ningún producto vegetal que utilice ingeniería genética basada en RNAi ha pasado todavía la fase experimental, los esfuerzos en el desarollo de estos productos han reducido con éxito los niveles de alérgenos en plantas de tomate y han disminuido los precursores de carcinógenos probables en plantas de tabaco. Otras características vegetales que han sido modificadas en el laboratorio incluyen la producción de productos naturales no-narcóticos en opium poppy, resistencia a virus de plantas comunes y refuerzo de plantas como los tomates con antioxidantes dietéticos. Productos comerciales previos, como el tomate Flavr Savr y dos cultivares de papaya resistentes al virus anillado de la papaya, fueron originalmente desarrollados utilizando tecnología antisense, pero probablemente explotaban la ruta del RNAi.